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 随着荧光定量PCR技术的广泛应用，化学发光材料也不断被开发，荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两大类：荧光探针和荧光染料，最常用的有以下5种，其原理简述如下：
◇ SYBR green I
◇ 水解探针TaqMan
◇ 分子信标
◇ 荧光标记引物
◇ 杂交探针
SYBR green I 荧光染料能特异性地掺入双链D NA分子的小沟部位，发射荧光信号。在PCR反应体系中，当SYBR Green染料与双链DNA结合，在激发光的作用下发出荧光，通过荧光强度的测定，即可确定双链DNA的含量。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。但是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，容易产生假阳性信号。引物二聚体的所引起的假阳性问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。
水解探针法目前在荧光定量中最广泛使用的TaqMan系统就是运用了这个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET），因此探针完整时，检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5′-3′外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，具有高特异性与高敏感性。
分子信标（molecμlar beacon）是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，使得产生能量转移效应，而不发生荧光。当互补序列出现时，探针与DNA杂交，探针转变成一个开放的结构，呈线性，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。分子信标特别适用于检测点突变，这能区分只有一个核苷酸差异的不同DNA序列，而且其敏感性要远比同等长度的寡核苷酸探针高，分子beacon已被用于突变检测、病原体定量、病毒检测和胚胎的性别判断，它同时出用于多重PCR检测逆转录病毒。
荧光标记引物是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中。目前主要有两种：日出引物（sunrise primes）和蝎子引物（scorpion primes）。同Taqman探针和分子beacon相比，scorpion能更快地发射出荧光且信号更为强烈，其特异性也很高，因为只有在反应体系中存在特异的目的基因，探针-引物才会与之相结合。Scorpion是一种较新的荧光材料，具有良好的应用前景。
杂交探针（hybridization probe）使用两个特异的探针，其中上游的探针的3′端标记有供体荧光素（donor），而下游的探针的5′端标记有受体荧光素（acceptor）。在PCR中模板退火阶段，两探针同时与扩增产物杂交，并形成头尾结合的形式，使供体和受体荧光素距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移（FRET，此作用与上述水解探针的方式相反），使得受体荧光基团发出荧光；当两探针处于游离状态时，无荧光产生。由于反应中运用了两个探针，因此增加了方法的特异性。这一方法已被Roche公司生产的Lightcycler所应用，进行病原体检测、病毒荷载量的测定等领域。
目前使用比较多的的是SYBR green I荧光染料法和Taqman法。 | 
