最新荧光素酶:更多选择更明亮[新品推荐
　　在细胞和基因的微观世界中研究探索，遗传报告基因是非常有用的可视化和量化工具，具有广泛的应用。荧光素酶（萤光素酶）以出色的灵敏度、使用方便、可以定量检测而成为理想的报告基因。如今，不少新的荧光素酶涌现出来，更明亮、更绚丽，让我们来瞧瞧吧。 

     在细胞和基因的微观世界中研究探索，遗传报告基因是非常有用的"可视化和量化"工具，具有广泛的应用。荧光素酶（萤光素酶）以出色的灵敏度、使用方便、可以定量检测而成为理想的报告基因。
荧光素酶（萤光素酶）不是特定的分子，是一类中能催化产生生物发光的酶的统称，不同来源的荧光素酶各有特点，可催化底物发出不同颜色的光，有的还可以配合进行双色发光检测。这种酶最早的来源，也是最有代表性一种来自学名为Photinus pyrali’的北美萤火虫体内的萤光素酶，所以Promega公司一直采用萤光素酶作为其标准名称，而不用“荧光素酶”，一方面也有助于区分需要激发光源才可以生成激发荧光的荧光蛋白，而萤光素酶是一个催化底物分解的发光反应，荧光素酶在细胞内没有背景，因此可以检测非常微弱的表达，灵敏度更高。不过，随着发光检测设备的不断推进和升级，生物发光灵敏度高，检测方便的优势使得这类酶与荧光蛋白一起渐有取代其他报告基因的趋势。于是，越来越多新的并非来自萤火虫的新荧光素酶进入市场，不再是“萤光”的天下了，所以生物通这里还是沿用各品牌惯例，不做区分.
种类更多

来自萤火虫的荧光素酶是最经典的荧光素酶，这个61KD单体酶无需修饰直接具有酶活，催化反应依赖ATP，很适合作为遗传报告基因，也最为人熟知；此外还有Renilla（海肾）荧光素酶，只有36KD大小的蛋白，底物是腔肠素，只需要氧气，不需要ATP，发蓝色光，一直是萤火虫荧光素酶的替代，并常与萤火虫荧光素酶组合成为双色检测，或者作为内对照（Promega）。
那么，让我们来看看现在有哪些新荧光素酶了？
1. Gaussia荧光素酶，这是一种分泌型的蓝色荧光素酶，蛋白分子量更小，只有22KD，含有天然的分泌型信号肽，可以引导荧光素酶分泌到细胞培养上清中，从而无需裂解细胞即可检测报告基因活性。所表达的荧光素酶85%以上都会分泌至胞外，不过由于这种分泌型荧光素酶产生的信号比来自Firefly（萤火虫）或Renilla（海肾）的信号强很多倍，所以还可以在细胞裂解物中检测到细胞内残留的荧光素酶。分泌表达为检测带来很大的方便——不需要裂解珍贵的细胞，即可作活细胞实时动力学分析，连续时间曲线研究。可与红色萤火虫荧光素酶组合为双色检测系统。（Thermo，NEB）
2. Cypridina（海萤）荧光素酶也是一种分泌型荧光素酶，呈美丽的蓝紫色，蛋白分子量大小有62KD。同Gaussia一样，大部分荧光素酶产物会分泌到胞外，可对活细胞实施连续检测，非常方便。由于信号很强，细胞内残留的荧光素酶还足以进行常规的裂解细胞检测，可实现多重检测。Cypridina（海萤）荧光素酶可与红色萤火虫荧光素酶组合为双色检测。（Thermo，NEB）
3. Red Firefly（红色萤火虫）荧光素酶是一种胞内蛋白，与天然Firefly（萤火虫）荧光素酶(绿色)相比，其发射峰迁移至红光光谱区。这对于一直以来都是“绿肥红瘦”的荧光素酶真是好消息。正是由于Red Firefly（红色萤火虫）荧光素酶的这种光谱迁移，使其能够与Gaussia、Cypridina（海萤）或Green Renilla（绿色海肾）荧光素酶很好地区分开，从而可以组合使用（产品来自Thermo）。
4. 可共用同一底物的红、绿两色的叩头虫萤光素酶，大小一致，底物一致，相差只有几个氨基酸，是双色检测的好选择。（来自Promega）5. Green Renilla（绿色海肾）荧光素酶是一种胞内蛋白，与天然的Renilla（海肾）荧光素酶相比，在血清中稳定性更高，发光强度更好。因此，使用绿色海肾（Green Renilla）荧光素酶报告基因检测灵敏度更高。（Thermo Pierce公司产品）
同样作为理想报告基因的荧光蛋白如GFP如今早也已经是缤纷的七彩世界了，那么荧光蛋白和荧光素酶各自的特点在哪里呢？荧光蛋白并不是自身发光，而是需要一个激发光源才可以生成发射荧光，其发光能量来自于激发光。荧光蛋白的优点在于检测不需要底物，无创，也不需要干扰细胞即可进行连续检测；但激发光会引起背景荧光干扰（细胞、容器等在激发光源下也会产生一定的荧光），通常用于定性，或者半定量。而荧光素酶发光是一个酶促反应，需要加入底物后才有发光反应产生。分泌型的荧光素酶需要取出上清进行反应，对于胞内表达的荧光素酶来说还需要裂解细胞才能检测。其优点在于荧光素酶在细胞内没有背景，因此可以检测非常微弱的表达，具有超高的检测灵敏度及宽广的动力学检测范围，可以精确定量。
检测试剂灵敏度更高生物通 如今的荧光素酶来源各不相同，各有所长，对应的检测试剂自然也越来越多花样和讲究。
在过去只有萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的时代，因为这两者都是胞内表达，要检测需要先裂解细胞，而且萤火虫萤光素酶催化底物发光的持续时间比较短，对于批量处理来说需要配备自动进样装置的检测设备，委实有点儿麻烦。如今有了分泌型表达的荧光素酶，就可以直接取上清进行检测，无需裂解细胞，可作活细胞实时动力学分析，进行连续时间曲线研究，这就方便多了。分泌型荧光素酶进入液相后会不会因为稀释而大大降低信号强度？这看来不用担心，两大类分泌型的荧光素酶催化底物的发光信号比原来的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶要高出2-3个数量级，自然更灵敏，更适合微孔板检测。不仅如此，如今荧光素酶检测试剂可根据所产生的发光信号持续时间长短而细分为闪光型和辉光型。闪光型和辉光型发光信号的主要区别是它们的动力学行为不同。加入底物后，闪光型发光反应产生瞬时的发光信号，而辉光型发光反应产生稳定的发光信号，有的可持续数小时。不难想象，通常闪光型发光强度会更大，检测灵敏度比同类的辉光型酶发光强度更高。但辉光型检测试剂因为发光持续时间长，无需使用自动进样器，批处理起来也容易些。在选择检测试剂时需要特别注意。
Promega提供Steady-Glo和Renilla-Glo检测系统，添加辅助剂后的检测试剂可产生半衰期超过5小时的萤火虫萤光素酶发光信号，以及半衰期超过1小时的海肾萤光素酶发光信号。Renilla-Glo可直接裂解细胞，并减少腔肠素的自发萤光，只需一个加样步骤即可。种类最丰富的是Thermo公司，为4类不同的荧光素酶分别提供Glow（辉光型）和Flash（闪光型）检测试剂，从产品名可以清楚识别，直接选择所需种类即可，不易出错。NEB公司为两类分泌型荧光素酶提供共计四个检测试剂盒，其中两种Flex 检测试剂盒提供一种稳定剂，加入后可以增加信号半衰期。单萤光素酶检测的选择相当丰富，研究人员可以根据研究的需要自由组合不同的荧光素酶进行多重检测。
神奇的双报告检测新方法
说到多重检测，值得注意的是，在用荧光素酶定量基因表达时，通常会采用第二个报告基因作为内对照，使第一个报告基因的检测均一化，从而减少实验的变化因素干扰，比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞毒性，细胞转染和裂解的效率等。
双荧光素酶检测可用于以下研究方向：• 同时分析多个调控元件
• 同时分析多个信号转导通路• 单次筛选一个以上的靶点，包括脱靶效应
• 分析两个或多个通路之间的相互作用虽然在过去，也有采用荧光素酶结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)组合作为双报告基因体系，但荧光素酶定量检测可在几秒钟内完成, 而CAT, β-Gal和GUS则需要长时间的预处理；许多类型的细胞有内源β-Gal或GUS表达, 不利于准确定量报告基因的表达, 采用高温下预处理细胞裂解液可降低内源性β-Gal和CAT的干扰，但这些处理也会快速失活荧光素酶。因此,在此类双报告基因检测中, 必须以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液，相当麻烦。
Promega最先提供双萤光素酶报告基因技术，结合了萤火虫荧光素酶检测和海洋腔肠荧光素酶检测，可在单管中进行双荧光素酶报告基因检测,快速,灵敏,简便。但是早期的双萤光素酶技术需要先裂解细胞，检测萤火虫萤光素酶，然后淬灭萤火虫萤光同时激活海肾萤光素酶，再做第二个检测，看起来有点麻烦，如今提供了Dual-Glo改进成为加样-检测的均质试剂。不过最方便的还是Thermo的双分泌型检测：这是一种两步法的检测，可用于实时监测Gaussia分泌型荧光素酶和Cypridina（海萤）分泌型荧光素酶。这个双报告系统可对来自同一细胞培养上清的荧光素酶进行动力学测定，灵敏度高，不仅节省了样品处理时间，还降低了检测的差异性。这两种发光波长接近，不能用滤光片区分，需要将上清分为两组分别用两种底物检测两种酶活性。由于两种荧光素酶的底物完全不同，所以可以有效区分两种酶的活性。
除了双分泌型检测，Thermo公司还提供3组双报告基因检测（检测胞内荧光素酶• Gaussia –Red Firefly荧光素酶
• Cypridina –Red Firefly荧光素酶• Green Renilla –Red Firefly荧光素酶
欢迎索取荧光素酶相关产品的更多资料这是以光谱范围来分辨两种不同荧光素酶所产生的发光信号的方法，只需一步操作可实现双重检测。只用添加一种试剂（包含两种底物），即可通过转换滤光片对两种发光信号同时进行检测。这样就可以省去了淬灭步骤和分步检测的麻烦，在同一个样品中同时对不同荧光素酶活性进行测定，操作简单，结果同步性更好。其中的关键在于，每个组合中的两个报告基因的发射光谱波长相差足够远，能让仪器很好的区分开。这时可以看出Red Firefly荧光素酶的光谱红移的重要意义了吧。值得一提的是两种分泌型荧光素酶，前面介绍过，虽然大部分的表达产物分泌到胞外，但细胞内仍有足够强的荧光素酶活性，可用闪光或辉光型检测试剂来检测。
在实用中，荧光素酶的优势在于极高的灵敏度和宽广的动态范围可方便的进行定量分析。荧光素酶的灵敏度很大程度取决于产生荧光的强度。比较下来，分泌型荧光素酶，Cypridina（海萤）和Gaussia荧光素酶的发光强度最高，其次是Renilla（海肾）荧光素酶，最后是Firefly（萤火虫）荧光素酶。根据实验要求选好所用的荧光素酶类后，就好办了，通常各家公司都有提供不带启动子的MCS型载体，带CMV启动子或者SV40启动子，或者TK启动子的载体，然后载体还有不同的筛选抗生素基因可供选择。根据自己实验很容易能找到需要的启动子。另外还有个因素，就是转染效率。特别是双报告基因。经常会发现有人提问为什么荧光读数很小呀，到底转进去没有呀这样的问题，转染就是另外一个话题了，这里不再多说，读者可以参考生物通技术专栏的有关文章。
其他应用荧光素酶可被用做单报告基因在特定生物实验中研究某一生物学事件。因不同荧光素酶的发光光谱特性和底物都是不一样的，所以还可以将多个不同的荧光素酶组合使用，进行多重检测。
多重检测更适用于以下方面：• 同时研究多个基因的表达调控
• 降低脱靶效应• 识别两个或多个信号通路间的相互作用
• 将实验体系产生的“假象”归一化应用
• 启动子研究中分析顺式作用元件和反式作用因子• 药物筛选
• siRNA和miRNA筛选• 分泌途径及蛋白定位报告基因检测
• 活细胞的实时动态研究• 信号转导通路分析
• 难转染的细胞（包括干细胞和原代细胞）的研究• RNA 剪接研究